肺纖維化動物模型動物的選擇

目前，肺纖維化動物模型有采用體型較小鼠類（如小鼠、大鼠、倉鼠等）和兔。其中 C57BL/6 小鼠、BALA/C 小鼠、KM 小鼠和 ICR 小鼠，Wistar 大鼠和SD 大鼠是用于肺纖維化模型是常用的種類，也有選用體型較大的犬、豬、羊和靈長類動物等，模型選用的動物種類因研究目的和造模方法不同而異。

鼠類是較多選用的肺纖維化動物模型，體型小、體重輕、價格便宜，有氣管灌注、霧化吸入、經(jīng)鼻給藥、腹腔注射、靜脈注射等多種給藥方式，是常用的造模動物，但因其體型太小不適用于放射影像學的研究，需要通過解剖摘取肺部進行組織病理學檢查的方法判斷造模是否成功。

豬、猴等大型動物體型大，心臟及肺部組織結(jié)構(gòu)與人相似，并且可通過影像學方法在無創(chuàng)條件下動態(tài)觀察動物造模情況，但價格昂貴，操作較復雜。

造模方法

目前已建立多種誘發(fā)動物肺纖維化模型的方法，包括基因相關(guān)模型與非基因相關(guān)模型?；蛳嚓P(guān)模型是指通過基因工程使動物成為肺纖維化模型，而非基因相關(guān)模型是指在相同或相似的遺傳背景下，通過環(huán)境因素、藥物毒物或其他因素誘導得到的肺纖維化模型。

一、肺纖維化動物模型基因相關(guān)方法致肺纖維化模型

轉(zhuǎn)基因方法包括細胞因子過表達法、靶向Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷法。

1SD大鼠細胞因子過表達法致肺纖維化模型步驟

前期準備：AdTGF-β1223/225 及腺病毒空載體 -70℃保存，臨用前經(jīng)病毒稀釋液稀釋成 1×109pfu（病毒稀釋液由三種溶液構(gòu)成，其配制方法：A 液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.15 g，KH2PO4 0.2 g，加雙蒸水定容至100 mL，高壓消毒；B 液：CaCl2·2H2O 0.1 g 定容至 10 mL，高壓消毒；C 液：MgCl2·6H2O 0.1 g 定容至 10 mL，高壓消毒。用前取 98 mL A 液、1 mL B 液、1 mL C 液混合備用。

操作步驟：選用 SD 大鼠，體質(zhì)量（250±15） g，腹腔注射速眠新麻醉（0.4 mL·kg-1），無菌操作，剪開頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉，充分暴露氣管，經(jīng)喉頭下一次性注入 0.4 mL AdTGF-β1223/225 腺病毒液，手術(shù) 6 h 后觀察并記錄動物生理反應(yīng)。

模型驗證：分別與造模后 d 7、d 14、d 21，麻醉后開胸，左心室插管，先灌流溫熱（室溫）生理鹽水，剪開右心耳放血，待流出液變澄清后再緩慢灌流 4% 多聚甲醛水溶液（200 mL·30 min-1）。小心摘取整個肺和心，經(jīng)氣管恒壓（2 452 Pa）灌注 4% 多聚甲醛固定液 10 min，使肺泡恢復擴張狀態(tài)。沿縱軸切取肺組織浸入 4% 多聚甲醛固定液中固定 24 h，做常規(guī)石蠟包埋、石蠟切片、HE 染色和 Mallory 染色，光鏡觀察、攝片。

2靶向Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷法

靶向Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷法是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將白喉毒素受體與Ⅱ型肺泡上皮細胞啟動子通過載體融合，白喉毒素不斷刺激轉(zhuǎn)基因小鼠，致肺纖維化。通過敲除特定基因或?qū)胪蛔兓蚴够蛲蛔円材芙?strong>肺纖維化動物模型，與肺纖維化有關(guān)的基因包括：肺表面活性蛋白C、肺表面活性蛋白A2（SFTPA2）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）和端粒酶 RNA復合酶（TERC）。

轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)勢：基因技術(shù)造模方法比較于傳統(tǒng)造模方法，靶點明確，對篩選抗纖維化藥物意義重大。除此之外，通過誘導時間特定啟動子，可模擬肺纖維化晚期出現(xiàn)的臨床癥狀。

轉(zhuǎn)基因方法的劣勢：介導轉(zhuǎn)基因用的病毒載體本身具有潛在危害性，且人類肺纖維化是多基因多種因子作用的結(jié)果，因此單一的基因模型與多基因相關(guān)的肺纖維化模型存在一定差異。

二、非基因相關(guān)方法致肺纖維化模型

常用的非轉(zhuǎn)基因方法主要為物理化學方法，包括博萊霉su誘導法、平陽霉su誘導法、百cao枯誘導法、石棉誘導法、輻射誘導法?；瘜W誘導法及石棉誘導法通常通過皮下、靜脈注射，或者霧化吸入等途徑給藥，輻射誘導法則直接進行射線照射。

1博萊霉su致肺纖維化模型

博萊霉su誘導肺纖維化有氣管內(nèi)一次給藥或多次給藥，也有腹腔給藥、鼻內(nèi)給藥、靜脈給藥、霧化吸入多種方式。氣管內(nèi)一次給藥是常用的造模方式。

1.1 大鼠氣管內(nèi)注射博萊霉su致肺纖維化模型

步驟：選用健康雄性8~10 周齡 Wistar 大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，用 10% 水he氯醛（0.3 mL·100 g-1）腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥固定于實驗臺，開口器固定口腔，拉出舌，用壓she板壓舌腹，在額鏡直視下，趁動物吸氣瞬間迅速行氣管插guan（Ф 2 mm，4~5 cm），緩慢注入 5 mg·kg-1BLM 0.2~0.3 mL，立即旋轉(zhuǎn)動物，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，自由飲水、攝食，d 1、d 14、d 28 采集標本。

特點：氣管內(nèi)一次給藥法有給藥次數(shù)少、劑量小、制模時間短等優(yōu)點，但動物死亡率較高，操作復雜，急性肺損傷程度重、膠原代謝紊亂的程度輕，病灶分布不均，以支氣管周圍為顯著的特點。目前一次性氣管內(nèi)灌注博萊霉su誘導的動物肺纖維化是國內(nèi)外常用、受認可的肺纖維化模型。

1.2 倉鼠氣管內(nèi)注射博萊霉su致肺纖維化模型

步驟：取10 周齡雄性敘利亞倉鼠，用生理鹽水配制 1 U 博萊霉su溶液，單次氣管內(nèi)注射 0.1 mL，注射藥物 3 周后，取肺組織進行細胞原代培養(yǎng)，3H-TdR 整合實驗評估成纖維細胞增殖效果。

特點：氣管內(nèi)一次給藥法有給藥次數(shù)少、劑量小、制模時間短等優(yōu)點，但動物死亡率較高，操作復雜，急性肺損傷程度重、膠原代謝紊亂的程度輕，病灶分布不均，以支氣管周圍為顯著的特點。目前一次性氣管內(nèi)灌注博萊霉su誘導的動物肺纖維化是國內(nèi)外常用、受認可的肺纖維化模型。

1.3 大鼠腹腔內(nèi)注射博萊霉su致肺纖維化模型

步驟：選用健康雄性 8~10 周齡 Wistar 大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，每日腹腔注射 15 mg·kg-1 BLM 10 天，自由飲水、攝食，d 1、d 14、d 28 采集標本。

特點：腹腔內(nèi)給藥法具有給藥次數(shù)多、劑量大、制模時間長等缺點，但動物死亡率相對較低，且操作簡便，急性肺損傷程度較輕、膠原代謝紊亂的程度較重，病灶分布均勻，以胸膜下為顯著的特點。

1.4 小鼠鼻腔滴入博萊霉su致肺纖維化模型

步驟：選用 SPF 級雌性 ICR 小鼠，6~8 周齡，體質(zhì)量16~18 g，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，鼻腔滴注博萊霉su造模。用yi醚麻醉小鼠，后用微量移液器吸取 50 μL 博萊霉su溶液（15 mg·kg-1 進行干預），經(jīng)鼻腔緩慢滴入小鼠氣管內(nèi)，放入鼠籠內(nèi)安置，觀察其造模后一般情況。